Metody modulacji aktywności białek rodziny TET w komórkach - badania in vitro

Abstract

W DNA każdej komórki ludzkiego organizmu znajduje się dokładnie taka sama informacja genetyczna, pozwalająca uzyskać szereg unikalnych fenotypów, charakterystycznych dla komórek poszczególnych tkanek i narządów. Uzyskanie tak szerokiego spektrum potencjalnych fenotypów jest możliwe dzięki dokładnej i dynamicznej regulacji ekspresji genów, która leży u podstaw proliferacji, dojrzewania i różnicowania się komórek, a także umożliwia szybką odpowiedź na zmienne czynniki środowiskowe. Tak duża plastyczność ludzkiego genomu osiągana jest zarówno poprzez mechanizmy genetyczne zależne od sekwencji DNA, jak i procesy epigenetyczne, które stanowią dodatkową warstwę informacji, niezależną od sekwencji DNA. Do najlepiej poznanych epigenetycznych mechanizmów regulacji ekspresji genów należy metylacja DNA i niedawno poznana, aktywna demetylacja DNA, zależna od białek z rodziny TET (Ten-Eleven-Translocations), należących do grupy dioksygenaz zależnych od α-ketoglutaranu i jonów żelaza. Te nowo poznane enzymy, do których zalicza się białka TET1, TET2 i TET3 katalizują reakcje utleniania 5-metylocytozyny, produktu procesu metylacji DNA, do 5-hydroksymetylocytozyny, którą następnie utleniają do dalszych produktów – 5-formylocytozyny i 5-karboksycytozyny. I choć dwie ostatnie modyfikacje mogą być usuwane z DNA poprzez system naprawy BER i zastępowane niezmodyfikowaną cytozyną, to wraz z 5-hydroksymetylocytozyną, mogą pełnić rolę znaczników epigenetycznych, rozpoznawanych przez szereg białek takich jak czynniki transkrypcyjne czy też białka zaangażowane w remodelowanie struktury chromatyny. Białka rodziny TET posiadają także zdolność do enzymatycznego utleniania tyminy do 5-hydroksymetylouracylu, którego rola w DNA wciąż nie została dostatecznie dobrze poznana. Zaburzenia w aktywności białek TET, w tym mutacje w obrębie ich genów, są bardzo często spotykane w wielu nowotworach, zwłaszcza hematologicznych, u podstaw których leżą nieprawidłowości w proliferacji i różnicowaniu się komórek. Proces aktywnej demetylacji DNA, a w szczególności możliwość jej modulacji, budzi duże zainteresowanie świata naukowego. Dlatego też postanowiono zbadać wpływ szeregu drobnocząsteczkowych związków mogących modulować aktywność enzymatyczną białek TET w szerokim spektrum komórek ustalonych linii komórkowych nowotworów złośliwych człowieka, w tym na komórkach z funkcjonalnymi nokautami w obrębie genów TET. Wykonano liczne eksperymenty polegające na ekspozycji komórek badanych linii na związki kluczowe dla reakcji enzymatycznych, katalizowanych przez enzymy z grupy dioksygenaz, tj. α-ketoglutaran, jony żelaza i różne postaci witaminy C, jak również eksponowano komórki na potencjalne inhibitory aktywności białek TET tj. jony niklu i kobaltu czy deferoksyaminę. Ponadto przebadano wpływ innych, potencjalnie modulujących czynników, takich jak ditiotreitiol, tetrahydrourydyna, 5-azacytydyna czy stan hipoksji. Aktywność enzymatyczną białek TET, wyrażoną jako poziom epigenetycznych modyfikacji zasad azotowych mierzono w komórkowym DNA przy pomocy dwuwymiarowej ultrasprawnej chromatografii cieczowej z tandemową detekcją mas, z użyciem znakowanych stabilnymi izotopami standardów wewnętrznych. Wyniki przeprowadzonych eksperymentów wskazują na znikomy wpływ zwiększenia stężenia α-ketoglutaranu i jonów żelaza w medium hodowlanym na aktywność białek TET. Najprawdopodobniej związki te występują w komórce w stężeniach znacząco przewyższających zapotrzebowanie badanych reakcji i nie stanowią czynnika limitującego. Podobnie chelatacja jonów żelaza za pomocą deferoksyaminy, jak i ekspozycja na jony niklu, nie wpłynęła na zmianę aktywności tych enzymów, gdyż najprawdopodobniej jony żelaza, niezbędne dla aktywności białek TET pozostają ściśle związane z centrum aktywnym enzymu przez cały okres trwania białka w komórce. Co ciekawe, jony kobaltu istotnie wpłynęły na obniżenie poziomów epigenetycznych modyfikacji w DNA, w sposób odmienny od stanu hipoksji, który potencjalnie miały imitować. Najprawdopodobniej, przy braku w komórce związków specyficznie je chelatujących, jony kobaltu są zdolne wypierać żelazo z centrum aktywnego białek TET, hamując ich aktywność, co potencjalnie może stanowić kolejny mechanizm ich cytotoksyczności. Ze wszystkich przebadanych związków, największy, stymulujący wpływ na aktywność enzymatyczną białek TET miała witamina C, która indukowała wzrost poziomu epigenetycznych modyfikacji DNA w każdej ze zbadanych linii, co stanowi o uniwersalności jej mechanizmu działania. Co ciekawe, izomer L kwasu askorbinowego wydaje się mieć silniejsze działanie, niż izomer D, co wskazuje na to, iż jego wpływ na aktywność białek TET nie wynika jedynie z potencjału antyoksydacyjnego, ale również ze stereospecyficznych interakcji z białkami TET. Wyniki eksperymentów kinetycznych sugerują, iż obserwowane poziomy produktów procesu aktywnej demetylacji DNA są silnie korelują z wewnątrzkomórkowym stężeniem witaminy C, a mutacje w obrębie poszczególnych białek TET osłabiają i opóźniają reakcję komórek na ten związek. Co ciekawe, utrata aktywności poszczególnych białek TET skutkuje powstaniem specyficznych profili epigenetycznych, które w niewielkim stopniu poddają się modulacji, co wskazuje na odrębne funkcje tych enzymów. Ponadto wydaje się, iż białko TET2 ma największy udział w generowaniu 5-hydroksymetylocytozyny, 5-formylocytozyny i 5-karboksycytozyny, a także, będąc pozbawionym domeny CXXC, charakteryzuje się odmienną od pozostałych białek TET specyficznością względem miejsc hemimetylowanych, których najprawdopodobniej nie jest w stanie rozpoznawać. Co więcej, profil produktów utleniania 5-metylocytozyny w hemimetylowanym DNA, generowanym w komórkach eksponowanych na działanie 5-azacytydyny, jest zależny od statusu mutacyjnego lub aktywności poszczególnych białek TET. Obserwacje te mogą stanowić przesłankę do włączenia analizy statusu mutacyjnego białek TET u pacjentów przed zastosowaniem terapii czynnikami demetylującymi takimi jak 5-azacytydyna. Ponadto, przeprowadzone eksperymenty jasno wskazują, iż suplementacja komórek witaminą C w stężeniu 100 µmol/l pozwala niejako przywrócić prawidłową aktywność białek TET w modelach in vitro i in cellulo, co jest szczególnie istotne w przypadku badań nad aktywną demetylacja DNA. Wydaje się, iż suplementacja komórek stabilnymi formami witaminy C, na przykład solami kwasu askorbinowego zamkniętymi w nośnikach liposomalnych, powinna zbliżyć warunki hodowli komórkowej do warunków panujących w organizmie, a tym samym pozytywnie wpłynąć na jakość i rzetelność badań nad procesami wymagającymi optymalnej aktywności białek rodziny TET. Co więcej, wnioski płynące z przeprowadzonych eksperymentów stanowią przesłankę do dalszych badań nad wpływem witaminy C na procesy epigenetyczne, a także mogą w przyszłości być podwaliną dla nowych strategii terapeutycznych obejmujących synergiczne zastosowanie czynników demetylujących i witaminy C w leczeniu nowotworów złośliwych, w szczególności zaś nowotworów hematologicznych.

In the DNA of each cell of the human body there is exactly the same genetic information, which allows to obtain a number of unique phenotypes, characteristic for the cells of individual tissues and organs. Obtaining such a broad spectrum of potential phenotypes is possible thanks to the precise and dynamic regulation of gene expression, which underlies the proliferation, maturation and differentiation of cells, and enables a rapid response to changing environmental factors. Such a high plasticity of the human genome is achieved both through DNA sequence-dependent genetic mechanisms and epigenetic processes, which constitute an additional, sequence-independent information layer. One of the best-known epigenetic mechanisms of regulation of gene expression are: DNA methylation and recently discovered, active DNA demethylation, an enzymatic process dependent on the TET family proteins (Ten-Eleven-Translocations), members of α-ketoglutarate and iron-dependent dioxygenases. These newly discovered group of enzymes, including TET1, TET2 and TET3 proteins, catalyze the iterative oxidation reactions of 5-methylcytosine, a product of the DNA methylation process, to 5-hydroxymethylcytosine, which they subsequently oxidize to further products - 5-formylcytosine and 5-carboxycytosine. Although the last two modifications can be removed from DNA through the BER repair system and replaced with unmodified cytosine, together with 5-hydroxymethylcytosine, they can act as an epigenetic marker, recognized by a number of proteins such as transcription factors or proteins involved in chromatin remodeling. The TET family proteins also have the ability to enzymatically oxidize thymine to 5-hydroxymethyluracil, which role in the DNA has not yet been studied well enough. Abnormalities in the activity of TET proteins, including mutations within their genes, are very common in many types of cancer, especially hematological cancers, in which impairment of cell proliferation and differentiation are main driver factor. The process of active DNA demethylation, and in particular the possibility of its modulation, arouses great interest in the scientific world. Therefore, we decided to investigate the effect of a number of small molecule compounds that can modulate the enzymatic activity of TET proteins in a broad spectrum of established human cancer cell lines, including cells with functional knockouts within TET genes. We have performer numerous experiments in which cells of selected cancer cell lines were exposed to compounds that are crucial for enzymatic reactions, catalyzed by enzymes from the dioxygenase group, i.e., α-ketoglutarate, iron ions and various forms of vitamin C, as well as potential inhibitors of activity of TET proteins, i.e., nickel and cobalt ions or deferoxamine. Moreover, the effect of other, potentially modulating factors, such as dithiothreitol, tetrahydrouridine, 5-azacytidine and hypoxia was investigated. Enzymatic activity of TET proteins, expressed as the level of epigenetic modifications of nucleobases was measured in cellular DNA by two-dimensional ultraperformance liquid chromatography with tandem mass spectrometry, with incorporation of stable isotope-labeled internal standards. The results of our experiments show the negligible effect of increasing the concentration of α-ketoglutarate and iron ions in the culture medium on the activity of TET proteins. Most likely, these compounds are present in the cell in concentrations that significantly exceed the requirements of the TET- mediated reactions and do not constitute a limiting factor. Similarly, chelation of iron ions with deferoxamine, as well as exposure to nickel ions, did not change the activity of TET enzymes. Most likely iron ions, necessary for the activity of TET proteins, remain attached to the enzyme`s active center throughout the protein duration in the cell. Interestingly, cobalt ions significantly reduced levels of epigenetic modifications in DNA, in a way that differed from the hypoxic state they were supposed to mimic. Most likely, in the absence of specific chelating compounds in the cell, cobalt ions are able to displace iron from the active center of TET proteins, inhibiting their activity, which could potentially be another mechanism of cobalt cytotoxicity. Vitamin C had the greatest stimulating effect on the enzymatic activity of TET proteins of all tested the compounds. It induced an increase in the level of epigenetic DNA modifications in each tested cell line, which proves the universality of its mechanism of action. Interestingly, the L-isomer of ascorbic acid seems to have a stronger effect than the D-isomer, which indicates that its influence on the activity of TET proteins may not be due solely to the antioxidant potential and may potentially involve stereospecific interactions with TET proteins. The results of kinetic experiments suggest that the observed levels of active DNA demethylation products are significantly dependent on the intracellular concentration of vitamin C. Moreover, mutations within individual TET proteins weaken and delay the cells' response to this compound. Interestingly, the loss of individual TET proteins activity results in the formation of specific epigenetic profiles that can only be modulated to a small extent, which indicates the distinct functions of these enzymes. Moreover, it seems that the TET2 protein has the greatest share in the generation of 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine and 5-carboxycytosine and being devoid of the CXXC domain, it has a different from other TET proteins specificity for hemimethylated sites, which is most likely unable to recognize. Moreover, the profile of the oxidation products of 5-methylcytosine in hemimethylated DNA generated in cells exposed to 5-azacytidine is dependent on the mutational status or activity of individual TET proteins. These observations may constitute a rationale to include the analysis of the mutational status of TET proteins in patients prior to treatment with demethylating agents such as 5-azacytidine. Results of conducted experiments clearly show that supplementing cells with vitamin C in a concentration of 100 µM allows to restore the normal activity of TET proteins in in vitro and in cellulo models, which is particularly important in studies on active DNA demethylation. It seems that supplementing cells with stable forms of vitamin C, for example ascorbic acid salts enclosed in liposomal carriers, should bring the cell culture conditions closer to the conditions in the human body, and thus positively affect the quality and reliability of research in which optimal TET proteins activity is required. Moreover, the conclusions drawn from the conducted experiments constitute a premise for further research on the influence of vitamin C on epigenetic processes, and may in the future constitute the basis for new therapeutic strategies including the synergistic use of demethylating agents and vitamin C in the treatment of malignant neoplasms, in particular hematological neoplasms.