Wykorzystanie metod modelowania komputerowego do poprawy właściwości katalitycznych enzymu biotechnologicznego Hydrataza Nitrylowa

Abstract

Kataliza enzymatyczna umożliwia otrzymywanie produktów stosowanych przy syntezie leków, tworzyw sztucznych czy produkcji żywności. Hydrataza nitrylowa (NHaza) jest ważnym enzymem używanym w przemyśle do produkcji akrylamidu z akrylonitrylu w skali tysięcy ton. Celem pracy doktorskiej było modelowanie komputerowe zmian struktury kilku wariantów tego enzymu w niestandardowych warunkach w celu zrozumienia jego dynamiki i poprawy właściwości biotechnologicznych. Problemem jest to, że enzym ten traci swoją aktywność w wysokiej temperaturze oraz przy dużych (>50%) stężeniach produktu, czyli akrylamidu. Po wprowadzeniu opisującym znaczenie NHazy, dokonano szerokiego przeglądu badań z wykorzystaniem symulacji dynamiki molekularnej (MD) dotyczących enzymów, głównie biotechnologicznych, w rozpuszczalnikach niewodnych. W oparciu o oryginalne symulacje zbadano modyfikacje enzymu NHazy prowadzące do jej zwiększonej termostabilności. Te modyfikacje polegały na połączeniu podjednostek za pomocą peptydów. W innej NHazie, pochodzącej z bakterii o wysokiej termostabilności, ale niskiej aktywności, zaproponowano mutację punktową zwiększającą jej aktywność. Następnie, metodami MD zbadano możliwe przyczyny utraty aktywności przez białko w roztworach o wysokim stężeniu amidów. W skali 500 ns stosowanej w obliczeniach MD białko zachowuje swoją strukturę, ale zaobserwowano oznaki częściowej denaturacji. Najbardziej prawdopodobnym wytłumaczeniem utraty aktywności jest indukowana amidami zmiana struktury najbliższego sąsiedztwa centrum aktywnego oraz utrudniony transport amidów z kanału prowadzącego do centrum. W oparciu o obliczenia prezentowane w rozprawie zaproponowano szereg wariantów NHazy, które w badaniach eksperymentalnych wykazały przewidywaną zwiększoną stabilność. Przeprowadzone badania pozwalają lepiej poznać aktywność katalityczną białka stosowanego w biotechnologii. Enzymatic catalysis plays a crucial role in producing compounds used in the synthesis of medicinal drugs, plastics, and food products. Nitrile hydratase (NHase) is a key industrial enzyme, widely employed in the large-scale production of acrylamide from acrylonitrile, with annual outputs reaching thousands of tons. The primary aim of this doctoral thesis was to use computational modeling to investigate structural changes in NHase, examine its dynamic properties, and propose strategies to improve its biotechnological performance. One of the major challenges associated with NHase is its loss of activity under high temperatures and elevated concentrations (>50%) of its product, acrylamide. Following an introductory chapter outlining the industrial significance of NHase, the thesis includes a comprehensive review of molecular dynamics (MD) studies on enzymes, particularly those with biotechnological applications in non-aqueous solvents. Original simulations were conducted to explore modifications aimed at enhancing NHase thermostability, including connecting its two subunits with peptide linkers. Additionally, a different NHase variant, derived from thermophilic bacteria with naturally high thermostability but low activity, was studied. A specific point mutation was introduced to increase its activity. MD simulations were also employed to investigate potential causes of activity loss in solutions with high acrylamide concentrations. Over the course of 500 ns, the protein retained its overall structure; however, early signs of partial denaturation were observed. The most plausible explanation for the loss of activity is a structural alteration in the of the close vicinity of active site caused by amides, along with impaired transport of amides through the tunnel leading to the active center. Based on the computational findings presented in this thesis, NHase mutants with improved stability were designed and experimentally tested, demonstrating enhanced performance. This study provides valuable insights into the catalytic activity of NHase, contributing to the optimization of its industrial applications.