Antymutagenne białko MTH1 - rola biologiczna, regulacja aktywności enzymatycznej oraz znaczenie w procesie nowotworzenia, 124 s.

Abstract

Rozprawa ta stanowi podsumowanie opublikowanych wcześniej prac badawczych poświęconych antymutagennemu białku MTH1 ssaków, jego biologicznej roli, regulacji aktywności enzymatycznej oraz znaczeniu w procesie nowotworzenia. Białko MTH1 jest enzymem z grupy pirofosfohydrolaz, degradującym 5'-trifosforany nukleozydów purynowych do 5'-monofosforanów nukleozydów oraz nieorganicznego pirofosforanu. Enzym ten wykazuje szczególnie wysokie powinowactwo do niektórych produktów oksydacyjnych uszkodzeń 2'-deoksyguanozyno-5'-trifosforanu (dGTP) oraz 2'-deoksyadenozyno-5'-trifosforanu (dATP), które są substratami w procesie syntezy DNA. Jednym z najlepiej opisanych mutagennych nukleotydów, które mogą powstawać w komórce pod wpływem reaktywnych form tlenu, jest 8-oksy-2'-deoksyguanozyno-5'-trifosforan (8-oxo-dGTP). Jest on substratem dla licznych polimeraz DNA, które inkorporują go w postaci monofosfonukleozydu do nowosyntetyzowanej nici DNA w trakcie procesu replikacji. Z uwagi na zdolność parowania 8-oksy-2'-deoksyguanozny z 2'-deoksyadenozyną i 2'-deoksycytydyną, inkorporacja taka powodować może powstawanie mutacji punktowych po kolejnych rundach replikacyjnych (głównie transwersji AT do CG). Obecnie zakłada się, że zasadnicza funkcja biologiczna białka MTH1 polega na zapobieganiu mutacjom punktowym poprzez oczyszczanie puli wolnych nukleotydów z powstającego w komórkach 8-oxo-dGTP, który jest szczególnie efektywnie degradowany przez MTH1. W ramach przedstawionej rozprawy opracowano metodykę oznaczeń specyficznej aktywności 8-oxo-dGTPazowej białka MTH1 w komórkach i tkankach ssaków. Praktyczne zastosowanie tej metody umożliwiło: a) przeprowadzenie kinetycznej charakterystyki degradacji 8-oxo-dGTP przez białko MTH1 człowieka i chomika, b) poszukiwanie zależności pomiędzy poziomem aktywności 8-oxo-dGTPazowej białka MTH1 a zawartością promutagennej 8-oksy-2'-deoksyguanozyny w DNA tkanek mysich, c) zbadanie wpływu karcynogennych jonów kadmu i niklu in vivo na aktywność 8-oxo-dGTPazową białka MTH1 i zawartość 8-oksy-2'-deoksyguanozny w DNA narządów szczura oraz zaproponowanie nowego mechanizmu karcynogenezy wywoływanej przez jony Cd2+ w jądrach gryzoni, d) identyfikację całej klasy inhibitorów aktywności enzymatycznej białka MTH1 (5'-difosforanów nukleozydów), kinetyczną charakterystykę ich właściwości oraz analizę ich potencjalnego wpływu na efektywność hydrolizy 8-oxo-dGTP in vivo, e) poszukiwanie wyjaśnienia dla zróżnicowanego poziomu ekspresji białka MTH1 w różnych typach komórek fizjologicznych oraz jego nadekspresji w komórkach nowotworowych; w ramach tych poszukiwań określono wpływ różnych stanów fizjologicznych komórek w populacji na poziom aktywności 8-oxo-dGTPazy, w tym: faz cyklu komórkowego, fizycznych oddziaływań międzykomórkowych oraz tempa proliferacji.

"Antimutagenic MTH1 protein – biological role, regulation of its enzymatic activity and involvement in carcinogenesis".

This D.Sc. dissertation summarizes the results of the research devoted to antimutagenic MTH1 protein, its biological role, regulation of enzymatic activity, and involvement in carcinogenesis. The MTH1 protein is a pyrophosphohydrolase that degrades purine nucleoside 5'-triphosphates to the corresponding nucleoside 5'-monophosphate and inorganic pyrophosphate. The enzyme hydrolyzes most specifically some products of oxidative damage to 2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate (dGTP) and 2'-deoxyadenosine 5'-triphosphate which are substrates for DNA synthesis. One of the best characterized mutagenic nucleotides is 8-oxo-2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate (8-oxo-dGTP) which likely forms in the cells under attack of reactive oxygen species. It is an erroneous substrate for many DNA polymerases that incorporate its monophosphate residue to a nascent DNA strand during DNA replication. Such an incorporation causes point mutations during subsequent replication rounds due to mispairing properties of 8-oxo-2'-deoxyguanosine that may form stable pairs with deoxycytidine as well as with deoxyadenosine. As MTH1 protein very effectively hydrolyzes 8-oxo-dGTP, its widely accepted function is assigned to preventing point mutations by sanitization of this promutagenic nucleotide out of cellular free nucleotide pool.

Within the framework of this dissertation an assay of specific 8-oxo-dGTPase activity of MTH1 protein in biological material was developed and validated. The elaborated method allowed subsequently for the following research to be carried out: a) a kinetic characteristics of 8-oxo-dGTP hydrolysis by murine and human MTH1 proteins, b) investigations on the possible impact of 8-oxo-dGTPase activity on 8-oxo-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dG) content in DNA of mouse organs, c) in vivo investigations on the effects of cadmium(II) and nickel(II) ions on the 8-oxo-dGTPase activity and 8-oxo-dG level in DNA of rat organs that resulted in a proposal of a new mechanism of cadmium testicular carcinogenesis in rodents, d) an identification and kinetic description of a whole class of mammalian 8-oxo-dGTPase activity inhibitors (nucleoside 5'-diphosphates) and the analysis of their potential influence on the effectiveness of 8-oxo-dGTP decomposition in vivo, e) a search for explanation to diverse MTH1 expression levels in different physiological cell types and MTH1 overexpression in cancer cells; in order to partially elucidate those phenomena different experimental approaches were used to relate cellular 8-oxo-dGTPase activity of MTH1 protein to cell cycling, proliferation rate and cell-to-cell contact.