Metabolizm pochodnych 8-oksyguaniny, 138 s.

Abstract

Reaktywne formy tlenu, takie jak rodnik hydroksylowy i tlen singletowy, mogą reagować z resztami guaniny stanowiącej składnik nukleozydów, nukleotydów i kwasów nukleinowych (DNA i RNA), przeprowadzając ją w oksydacyjną pochodną - 8-oksyguaninę. 8-Oksyguanina powstająca w DNA jest źródłem mutacji punktowych typu GC=>TA z powodu jej potencjału błędnego parowania z adeniną. Ta zmodyfikowana zasada może być również wprowadzana do DNA w trakcie procesu replikacji z 8-oxodGTP, powstającego na skutek oksydacyjnej modyfikacji normalnego substratu do syntezy DNA - dGTP. 8-oxodGMP wprowadzony tą drogą do cząsteczki DNA powoduje najczęściej transwersje typu AT=>CG. 8-Oksy-2’-deoksyguanozyna (8-oxodG) jest obecnie najpowszechniej używanym markerem uszkodzeń oksydacyjnych DNA, oznaczanym zarówno w DNA jak i w moczu, poprzez który jest wydalana z ustroju jako produkt naprawy DNA. Obiektem tej pracy było kilka aspektów metabolizmu pochodnych 8-oksyguaniny:

1. Promieniowanie jonizujące jest jednym z najlepiej rozpoznanych czynników powodujących oksydacyjną modyfikację guaniny. Badano wpływ terapeutycznych dawek promieniowania rentgenowskiego na powstawanie 8-oxodG w limfocytarnym DNA ludzi. U czterech chorych na raka, leczonych radioterapeutycznie dawką sumaryczną 3000 cGy stwierdzono około dwukrotny wzrost ilości 8-oxodG w DNA limfocytów. Zjawisko to może mieć związek z wtórnymi nowotworami pojawiającymi się czasem u chorych na raka, leczonych radioterapeutycznie.

2. Mutagenny efekt zmodyfikowanej zasady znajdującej się w matrycy DNA zależny jest nie tylko od jej potencjału błędnego parowania, ale także od stabilności produktu modyfikacji w DNA. W celu określenia względnej stabilności 8-oxodG, zbadano kinetykę hydrolizy dG i jej oksydacyjnej pochodnej - 8-oxodG, w warunkach podwyższonej temperatury i przy różnym pH. Dowiedziono zdecydowanie wyższej stabilności 8-oxodG w porównaniu z niezmodyfikowaną dG. Świadczy to o tym, że 8-oksyguanina może być usuwana z DNA tylko na drodze enzymatycznej naprawy. W warunkach obniżonej efektywności systemów naprawy DNA wysoka stabilność 8-oxodG umożliwia jej kumulowanie się w DNA, co prowadzić może do podwyższenia tempa powstawania mutacji punktowych w obrębie genomu komórki.

3. 8-Oksy-2’-deoksyguanozyna oraz 8-oksyguanina obecne w moczu ssaków uważane są za specyficzne markery uszkodzeń oksydacyjnych DNA zachodzących in vivo. Aby związek mógł być traktowany jako specyficzny marker uszkodzeń oksydacyjnych DNA nie może on powstawać w żadnych procesach enzymatycznych i musi być absolutnie końcowym produktem naprawy DNA, który nie jest dalej degradowany. W związku z tym, w pracy tej badano potencjalne możliwości degradacji i powstawania 8-oxoGua i 8-oxodG pod wpływem enzymów szlaku katabolicznego klasycznych nukleozydów purynowych. Wykazano, iż 8-oxodG nie jest substratem dla fosforylazy nukleozydów purynowych i nie może być degradowana przez ten enzym do wolnej 8-oxoGua i deoksyrybozo-1-fosforanu. Dowiedziono również, że guanaza (enzym katalizujący hydrolityczną dezaminację guaniny do ksantyny) nie katalizuje dezaminacji 8-oksyguaniny do kwasu moczowego. Przebadano również potencjalną możliwość powstawania 8-oxoGua w procesie enzymatycznej oksydacji guaniny przez oksydazę ksantynową. Wykazano, iż guanina nie jest przekształcana do 8-oksyguaniny pod wpływem tego enzymu. Wyniki te potwierdzają słuszność założenia, iż 8-oxodG i 8-oxoGua mogą być traktowane jako specyficzne markery uszkodzeń oksydacyjnych DNA.

4. Dzięki opracowaniu metody selektywnego oznaczania aktywności pirofosfatazy 8-oxodGTP (hMTH1, ludzkiego homologu bakteryjnego białka MutT) w ekstraktach białkowych z tkanek, zbadano wpływ promieniowania jonizującego na aktywność pirofosfatazy 8-oxodGTP w hodowanych fibroblastach ludzkich linii VH16, VH25 i VH25A. Stwierdzono, że naświetlenie fibroblastów dawką promieniowania X, która wywołuje w typowych eksperymentach odpowiedź adaptacyjną komórek, nie wpływa na poziom ekspresji tego enzymu. Mogłoby to świadczyć o tym, że gen kodujący pirofosfatazę 8-oxodGTP nie znajduje się pod kontrolą czynników transkrypcyjnych aktywowanych przez reaktywne formy tlenu.

5. Wszystkie powyższe badania mogły zostać przeprowadzone dzięki wykonanym w ramach tej pracy syntezom: 8-oksy-2’-deoksyguanozyny oraz jej dwu fosforanowych pochodnych 5’-monofosforanu oraz 5’-trifosforanu.