Fluorescence Spectroscopy of Collagen in Several Solvents

Abstract

Introduction. Research was carried out into the influence of microenvironment created by 6 solvents on the spectroscopic characteristics of four types of collagen protein. The solvents were selected on the basis of polarity, pH, the presence of a functional group, as well as their application in fixing biological material for histopathological and spectroscopic examinations. As an amino acid with the highest light-absorbing capacity, tryptophan exhibits the spectral properties of whole protein agglomerates. Protein conformation changes occurring in different environments and changes in functional groups surrounding tryptophan allowed to register protein spectra. The aim of the study was to find out whether changing the collagen microenvironment using six selected solvents allows to differentiate four types of collagen by means of stationary fluorescence spectroscopy. Material and methods. The research material consisted of four types of human collagen: I, II, III, and IV. The classification of collagen types was based on the spatial arrangement of α chains of each collagen type as adopted by Bornstein and Traub. The emission spectra were recorded with the use of a Hitachi F-7000 spectrofluorimeter and analysed with Origin 8.0 Pro software. Results. Preliminary tests allowed to determine the most optimal excitation wavelength of polar (λ = 270 nm) and non-polar (λ = 350 nm) solvents. The observed spectra shapes and maxima at a specific excitation wavelength were characteristic for the corresponding solvent. Differences among the fluorescence spectra of the four types of collagen were not observed. Conclusions and discussion. Stationary fluorescence spectroscopy does not allow to differentiate four collagen types using the selected solvents. A major hindrance of this method consists in its high sensitivity to environment changes which may preclude the optimisation of research and in consequence render the approach inferior to techniques using electrophoretic devices, mass spectrometry, or chromatography.

Wstęp. Przeprowadzono badania wpływu mikrośrodowiska wybranych sześciu rozpuszczalników na właściwości spektroskopowe czterech typów białka kolagenowego. Rozpuszczalniki zostały wyselekcjonowane na podstawie polarności, pH, obecności grup funkcyjnych, a także wykorzystania ich do utrwalania materiału biologicznego do badań histopatologicznych, jak również badań spektroskopowych. Tryptofan, jako aminokwas o najsilniejszej zdolności absorbowania światła odwzorowuje spektralne właściwości całych aglomeratów białkowych. Zmiany konformacyjne białka w różnym środowisku oraz zmiany otaczających tryptofan grup funkcyjnych pozwoliły na zarejestrowanie widm białek. Celem badania było sprawdzenie, czy zmiana mikrośrodowiska kolagenu z wykorzystaniem sześciu wybranych rozpuszczalników pozwoli na różnicowanie czterech typów kolagenu metodą stacjonarnej spektroskopii fluorescencyjnej. Materiały i metody. Materiał do badań stanowiły cztery typy kolagenu ludzkiego: I, II, III i IV. Podział typów kolagenu opierał się na przyjętym przez Bordsteina i Trauba ułożeniu przestrzennym łańcuchów α każdego z typów kolagenu. Widma emisji rejestrowane były przy użyciu spektrofluorymetrumetru Hitachi F-7000 i opracowane z wykorzystaniem programu Origin 8.0 Pro. Wyniki. Badania wstępne pozwoliły na wyznaczenie najbardziej optymalnych długości fali wzbudzenia dla rozpuszczalników polarnych (λ = 270 nm) i niepolarnych (λ = 350 nm). Obserwowany kształt oraz maksimum widm przy określonej długości fali wzbudzenia był charakterys-tyczny dla odpowiedniego rozpuszczalnika. Nie zaobserwo-wano różnic w widmach fluorescencji pomiędzy czterema typami kolagenu. Wnioski i dyskusja. Stacjonarna spektroskopia fluorescencyjna nie pozwala na rozróżnienie czterech typów kolagenu z zastosowaniem wybranych rozpuszczalników. Dużym utrudnieniem w pomiarach fluorescencyjnych stanowi jej wysoka czułość na zmiany środowiska, która niestety może powodować uniemożliwienie optymalizacji badań, dlatego ustępuje miejsca metodom z użyciem aparatury elektroforetycznej, spektrometrii mas lub chromatografii.