Hydrożele kolagenowo-elastynowe dla inżynierii tkankowej sieciowane skrobią dialdehydową oraz pektyną

Abstract

Zadaniem inżynierii tkankowej jest stworzenie optymalnego materiału o odpowiednich właściwościach, który mógłby służyć jako zamiennik uszkodzonej tkanki, bądź narządu i wspomóc jej regenerację. Skafoldy opierają się przede wszystkim na naturalnych polimerach, w szczególności na kolagenie i elastynie, które występują w strukturze macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) [1]. Włókna kolagenowe oraz ich sieci tworzą ECM dla większości tkanek miękkich i twardych tj. kości, chrząstek, ścięgien oraz skóry w organizmie człowieka [2]. Kolagen występuje w odmiennych strukturach morfologicznych w różnych tkankach [3,4]. Wszystkie typy kolagenów wykazują charakterystyczną strukturę potrójnej helisy. Wyróżnić wśród nich możemy kolageny fibrylarne i niefibrylarne [5,6]. Sekwencja aminokwasowa kolagenu układa się w charakterystyczny tryplet -Gly-X-Y- . Obecność glicyny w każdej trzeciej pozycji aminokwasowej jest niezbędna w celu umożliwienia szczelnego upakowanie trzech α łańcuchów w cząsteczce tropokolagenu, natomiast pozycje X i Y są w większości zajęte przez prolinę i 4-hydroksyprolinę [5]. Elastyna jest wysoce usieciowanym, nierozpuszczalnym biopolimerem, składającym się z kowalencyjnie związanych cząsteczek tropoelastyny. Posiada niezwykły skład aminokwasowy, bo aż 75% jej zawartości stanowią aminokwasy hydrofobowe: glicyna, walina i alanina [7,8]. W procesie tworzenia wiązania sieciującego w elastynie uczestniczą dwa łańcuchy tropoelastyny, między którymi z reszt lizyny pod wpływem działania oksydazy lizylowej powstaną wiązania desmozyny, bądź izodesmozyny [9]. Materiały białkowe sieciuje się, w celu poprawienia ich właściwości fizycznych, chemicznych, mechanicznych oraz odporności na degradację [10]. Skrobia dialdehydowa stanowi polimeryczny dialdehyd wytwarzany na skutek selektywnego utleniania skrobi nadjodanem, który rozszczepia wiązanie C2-C3 łańcucha polisacharydowego skrobi z wytworzeniem dwóch grup aldehydowych [11]. Pektyna jest polisacharydem składającym się głównie z reszt kwasu D-galakturonowego, zestryfikowanych grupami metylowymi [12]. Celem pracy było określenie efektywności sieciowania materiałów kolagenowych oraz kolagenowo-elastynowych przy użyciu skrobi dialdehydowej oraz pektyny, porównanie otrzymanych wyników sieciowania materiału białkowego skrobią dialdehydową z wynikami uzyskanymi dla materiałów sieciowanych pektyną oraz uzyskanie materiałów dla zastosowań w inżynierii tkankowej. Kolagen został otrzymany ze ścięgien szczurzych ogonów. Hydrolizaty elastyny zostały otrzymane poprzez izolację ze świńskich aort. Otrzymany liofilizat kolagenu rozpuszczono w 0,1M kwasie octowym i otrzymano 1% roztwór kolagenu, natomiast sproszkowany liofilizat hydrolizatów elastyny rozpuszczono w wodzie destylowanej i otrzymano 1% roztwór elastyny. Mieszaniny kolagenowo-elastynowe składały się objętościowo z 95% kolagenu i 5% elastyny oraz 90% kolagenu i 10% elastyny. Tak otrzymane mieszaniny sieciowano przy użyciu skrobi dialdehydowej oraz pektyny przez dodatek odpowiedniej ilości danego czynnika sieciującego (5% oraz 10% dodatek objętościowy). Dializa otrzymanych układów była przeprowadzona względem wody dejonizowanej i trwała 7 dni. Otrzymane żele zostały poddane odpowiednim analizom. Zliofilizowane hydrożele wykazują porowatą strukturę, co potwierdzają obrazy ze skaningowego mikroskopu elektronowego. Wielkość porów jest niejednorodna. Analiza obrazów SEM dowodzi, że ich rozmiar jest zróżnicowany i zależy zarówno od dodatku hydrolizatów elastyny, jak i ilości i rodzaju czynnika sieciującego. Wyższa zawartość hydrolizatów elastyny powoduje spadek wartości modułu sprężystości otrzymanych żeli. Sieciowania skrobią dialdehydową prowadzi do zwiększenia sztywności żeli, podczas gdy próbki zawierające pektynę są mniej odporne na ściskanie. Badanie odpowiedzi komórkowej dla otrzymanych hydrożeli dowodzi, iż materiał ten jest atrakcyjny dla fibroblastów mysich 3T3. W przypadku serii próbek z 5% i 10% dodatkiem hydrolizatów elastyny, sieciowanie tego materiału skrobią dialdehydową korzystnie wpływa na wzrost przeżywalności komórek 3T3. Dodatek skrobi dialdehydowej i pektyny powoduje tworzenie się wiązań sieciujących w otrzymanym materiale. Jednakże żele zawierające skrobię dialdehydową są znacznie bardziej sztywne niż materiały sieciowane pektyną. Wyniki te ukazują, że skrobia dialdehydowa jest lepszym środkiem sieciującym niż pektyna. Skrobia dialdehydowa może znaleźć zastosowanie, jako środek sieciujący dla materiałów białkowych stosowanych w medycynie i inżynierii tkankowej. Autorzy pragną podziękować Narodowemu Centrum Nauki (NCN, Polska, Grant nr: UMO-2011/03/D/ST8/04600) za zapewnienie wsparcia finansowego na realizację tego projektu. Literatura: [1] M. Martowicz, J. Laska (2010) Biomateriały polimerowe w regeneracji ubytków skóry, Inżynieria Biomateriałów 13 (95):2-6, [2] A. Kuzan, A. Chwiłkowska (2011) Różnorodność i funkcje kolagenu w tętnicach, Polski Merkuriusz Lekarski 31(182):111-112, [3] S. A. Sell, P. S. Wolfe, K. Garg, J. M. McCool, I. A. Rodriguez, G. L. Bowlin (2010) The Use of Natural Polymers in Tissue Engineering: A Focus on Electrospun Extracellular Matrix Analogues, Polymers 2:524, 527, [4] R. Parenteau-Bareil, R. Gauvin, F. Berthod (2010) Collagen – Based Biomaterials for Tissue Engineering Applications, Materials 3:1864-1869, [5] K. A. Czubak, H. M. Żbikowska (2014) Structure, function and biomedical significance of collagens, Annales Academiae Medicae Silesiensis 68(4):246-253, [6] W. Friess (1998) Collagen – biomaterial for drug delivery, European Journal of Pharmaceutices and Biopharmaceutics 45(2):114-116, [7] W. F. Daamen, J. H. Veerkamp, J. C. M. van Hest, T. H. van Kuppevelt (2007) Elastin as a biomaterial for tissue engineering, Biomaterials 28(30):4379-4386, [8] S. M. Mithieux, J. E. J. Rasko, A. S. Weiss (2004) Synthetic elastin hydrogels derived from massive elastic assemblies of self-organized human protein monomers, Biomaterials 25(20):4921-4922, [9] N. Annabi, S. M. Mithieux, G. Camci-Unal, M. R. Dokmeci, A. S. Weiss, A. Khademhosseini (2013) Elastomeric recombinant protein-based biomaterials, Biochemical Engineering Journal 77:111-114, [10] W. Dzierża, T. Czerniawski (2000) Właściwości mechaniczne i termiczne polimerów. Skrypt dla studentów chemii, wyd. Uniwersytet Mikołaja Kopernika, Toruń, [11] L. Song, C. Cruz, S. R. Farrah, R. H. Baney (2009) Novel antiviral activity of dialdehyde starch, Electronic Journal of Biotechnology 12(2):1-2, [12] A. G. J. Voragen, G.-J. Coenen, R. P. Verhoef, H. A. Schols (2009) Pectin, a versatile polysaccharide present in plant cell walls, Structural Chemistry 20(2):263, 264, 267.